纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合骨组织工程支架材料的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.08.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (8): 1149-1154.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.08.001

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纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合骨组织工程支架材料的生物相容性

年争好^1，2，3，李晖¹，李瑞欣²，孙凯^1，2，3，李东^1，2，3，徐成²，张西正²

¹天津医科大学总医院，天津市 300052；²解放军军事医学科学院卫生装备研究所，天津市 300161；³天津医科大学，天津市 300070

修回日期:2015-01-08 出版日期:2015-02-19 发布日期:2015-02-19
通讯作者: 李晖，主任医师，硕士生导师，天津医科大学总医院骨科，天津市 300052 李瑞欣，副研究员，解放军军事医学科学院卫生装备研究所，天津市 300161
作者简介:年争好，男，1988年生，安徽省宿州市人，汉族，天津医科大学在读硕士，医师，主要从事骨与关节修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(11432016，31370942，11072266)

Biocompatibility of nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin composite scaffolds for bone tissue engineering

Nian Zheng-hao^{1, 2, 3}, Li Hui¹, Li Rui-xin², Sun Kai^{1, 2, 3}, Li Dong^{1, 2, 3}, Xu Cheng², Zhang Xi-zheng²

¹General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China; ²Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Science, Tianjin 300161, China; ³Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China

Revised:2015-01-08 Online:2015-02-19 Published:2015-02-19
Contact: Li Hui, Chief physician, Master’s supervisor, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China Li Rui-xin, Associate researcher, Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Science, Tianjin 300161, China
About author:Nian Zheng-hao, Studying for master’s degree, Physician, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China; Institute of Medical Equipment, Academy of Military Medical Science, Tianjin 300161, China; Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 11432016, 31370942, 11072266

摘要/Abstract

摘要：

背景：通过将两种及两种以上材料共混制备复合支架材料可以弥补各自的不足，利用各种材料的互补特性来满足组织工程对支架的要求。

目的：制备纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合三维支架材料，并研究其细胞相容性。

方法：将纳米羟基磷灰石、胶原蛋白与丝素蛋白分别按质量比为1∶1∶5、1∶2∶5、1∶3∶5的比例混合，制备纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合材料，测试其孔隙率、孔径大小、吸水膨胀率及压缩力学性能。将表征结果良好的质量比为1∶2∶5的纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合材料与MC3T3-E1细胞体外复合培养，MTT法检测复合培养2，4，6，8，12 d后的细胞活性。

结果与结论：羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白按质量1∶2∶5的比例混合更符合要求：孔径98-260 μm，孔隙率为(96.72±2.78)%，吸水膨胀率为(549.37±35.29)%，生物力学试验机测定其力学性能稳定、压缩应变及弹性模量等指标适宜骨组织工程研究应用。MC3T3-E1细胞在纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合三维支架上生长增殖良好，表明纳米羟基磷灰石/胶原/丝素复合三维支架具有良好的细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 丝素蛋白, 胶原蛋白, 纳米羟基磷灰石, 骨组织工程, 支架材料, 细胞相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Composite scaffolds made of two or more materials can meet the requirements of tissue engineering scaffolds based on the complementary properties of various materials.

OBJECTIVE: To prepare three-dimensional nano-hydroxyapatite (nHA)/collagen (COL)/silk fibroin (SF) scaffolds and to study their biocompatibility.

METHODS: Composite scaffolds were prepared by mixing nHA, COL and SF at different ratios of 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5. In order to find out the best mixing ratio of SF, COL and nHA, the porosity, pore size, water absorption and mechanical properties were determined. MC3T3-E1 cells were cultured in the nHA/COL/SF scaffolds composite scaffold (1:2:5) in vitro to observe the biocompatibility. Cell viability was detected after co-culture for 2, 4, 6, 8, 12 days using MTT.

RESULTS AND CONCLUSION: It was more suitable for bone scaffolds when the mixed ratio of nHA, COL and SF was 1:2:5. The pore size was 98-260 μm, the porosity was (96.72±2.78)%, and the water absorption was (549.37±35.29)%. The stability of its mechanical properties, compressive strain and elastic modulus and other indicators were measured by biomechanical testing machine, which are suitable for bone tissue engineering applications. MC3T3-E1 cells grew well in the nHA/COL/SF composite scaffold, indicating the composite scaffold has good cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: Collagen, Silk, Hydroxyapatites, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

年争好，李晖，李瑞欣，孙凯，李东，徐成，张西正. 纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合骨组织工程支架材料的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(8): 1149-1154.

Nian Zheng-hao, Li Hui, Li Rui-xin, Sun Kai, Li Dong, Xu Cheng, Zhang Xi-zheng. Biocompatibility of nano-hydroxyapatite/collagen/silk fibroin composite scaffolds for bone tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(8): 1149-1154.

图/表（结果） 3

2.1 纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白三维支架材料大体观察 纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合支架外观呈乳白色，表面光滑，有弹性，压缩可变形，去除外力后可自动恢复至原状，见图1。

2.2 纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白混合支架扫描电镜观察 纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白材料具有不规则的多孔结构，交通孔丰富、相通性好，孔径98-260 μm，各组平均孔径见表1，总的平均孔径为167 μm，孔隙率为(96.72±3.78)%，见图2。

2.3 纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白支架孔隙率及吸水膨胀率测定结果 通过不同的比例混合，测得各组纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白材料孔隙率和吸水膨胀率随着胶原蛋白混合的比例增大呈现下降趋势，见表1，结果显示1∶2∶5的混合比例支架孔隙率及吸水膨胀率较佳。

2.4 纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白支架的压缩力学性能 将外观完好的支架置于Instron5865力学试验机载物台处，启动机器，设置相应参数，测试支架压缩力学性能，其结果显示混合支架材料的平均弹性模量(杨氏模量，压缩应变2%-8%)为33.59 kPa，见表2；其压缩的应力应变曲线见图3。

2.5 复合支架的细胞相容性 将MC3T3-E1细胞与所制备的三维支架材料(质量比为1∶2∶5)复合培养后，分别于2，6，8 d取出细胞/支架复合物，经固定处理、制成切片，苏木精-伊红染色后，镜下见细胞与支架材料黏附生长良好，细胞形态、生长状况未受支架材料影响，见图4。

细胞在支架内增殖的数量随着培养周期的延长而增多，取8 d细胞组织复合物做电镜观察，发现支架材料内部有大量细胞长入，细胞黏附、生长良好，见图5。

细胞与质量比1∶2∶5纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白支架复合培养2，4，6，8，12 d的吸光度值(A值)，见表3；可见A值均随培养时间增加而增大，前1周细胞增长迅速，后期细胞增殖相对较缓慢，因此生长曲线呈S形，见图6。

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引言

骨组织工程的出现为骨缺损修复带来了新的思路和方法。骨组织工程研究至今已取得很大进展，但仍存在许多问题亟待解决。支架材料作为骨组织工程的关键因素，目前仍旧没有可以作为“金标准”的支架，因此找到一种更加适合作为骨组织支架的材料是骨组织工程研究中急需解决的难点之一。

大量的研究表明丝素蛋白、胶原蛋白和羟基磷灰石，无毒无味，具有良好的生物学特性和理化性质^[1-5]。羟基磷灰石是天然骨无机盐的主要成分，具有良好的骨传导性与生物相容性^[6-7]，被认为是骨缺损修复的理想材料，尤其是纳米级羟基磷灰石与天然骨中的无机成分相似，引入到复合材料中可使材料在力学和生物学方面具有很大的优越性和应用潜力。但羟基磷灰石也有其自身的缺点，如生物力学强度不理想、骨诱导活性低等^[8-9]。

胶原是天然骨的主要有机成分，具有良好的生物相容性、生物降解性、刚性和抗张能力。当前，国内外相关骨组织工程材料研究中，选用的胶原蛋白大多为Ⅰ型胶原蛋白，这是因为天然骨组织中Ⅰ型胶原蛋白是含量最多的有机基质^[10]。丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然生物材料，无毒、无刺激、价廉、易获取，在生物医学有广泛的用途^[11-14]，其具有机械强度高、生物相容性良好、生物降解性慢、制备方法多样易得等特点，支持多种细胞黏附、分化和生长，可应用于人工韧带、软骨、骨、神经组织等方面^[15-16]。但单独使用时都暴露一些不足，如丝素降解较慢、干燥时易碎裂^[17]；胶原降解速度过快，机械强度较低^[18-19]；简单合成的羟基磷灰石材料成型后强度低、孔隙度小^[10^，^20]。而通过将两种及两种以上材料共混制备复合支架材料可以弥补各自的不足，利用各种材料的互补特性来满足组织工程对支架的要求，受到越来越多的关注^[21-22]。

鉴于此，本实验在实验室前期研究的基础上，将纳米羟基磷灰石、胶原蛋白与丝素蛋白的质量比分别设为 1∶1∶5、1∶2∶5、1∶3∶5，采用冷冻干燥法制备复合支架，以期探索符合骨组织工程支架材料的纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白最佳配比。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：材料学观察实验。

时间及地点：于2012年10月至2013年7月在解放军军事医学科学院卫生装备研究所实验室完成。

材料：纳米羟基磷灰石(南京埃普瑞公司)；Ⅰ型胶原溶液自制^[23]；丝素蛋白(浙江嘉兴)。MC3T3-E1细胞为本实验室长期冻存。

实验方法：

纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合支架材料的制备：将纳米羟基磷灰石、胶原蛋白与丝素蛋白分别按质量比1∶1∶5、1∶2∶5、1∶3∶5充分混合，移入24孔板中，4 ℃冰箱保存2 h，-20 ℃冰箱过夜，最后用冷冻干燥机冷冻干燥得到纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合支架。将支架放入无水乙醇中浸泡24 h，0.1 mol/L氢氧化钠处理1 h后，去离子水清洗干净，得到纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合三维支架。

纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合支架材料性能测试：

电镜观察：将各组支架冷冻干燥，喷金，扫描电镜观察其超微结构，并测其孔径大小。

孔隙率测定：采用改良的液体位移法测定支架孔隙率，将各组支架分别浸入体积为V1的无水乙醇量筒中，负压脱气至支架无气泡逸出，记录此时乙醇体积为V2，取出支架样品，剩余乙醇体积为V3，计算孔隙率。每组测3个样品，取平均值。

孔隙率(%)=(V1-V3)/(V2-V3)×100%

吸水膨胀率测定：取各组干燥支架，称质量记m1，浸入PBS中24 h取出，用滤纸吸干表面的水分称质量记m2，计算吸水膨胀率。每组测3个样品，取平均值。

吸水膨胀率(%)=(m2-m1)/m1×100%

压缩力学性能：取外观完好的支架，浸入PBS中24 h后取出，测得其直径为1.4 cm、高度1.0 cm，然后将支架置于Instron5865力学试验机载物台处，启动机器，设置参数为压缩应变10%、循环3周期载荷，测定支架的压缩力学性能。

细胞生物相容性检测：将性能测试结果较好比例的三维支架裁剪成直径4 mm、高度2 mm的圆柱状，灭菌处理后用α-MEM培养液浸泡24 h后备用。将MC3T3-E1细胞制成浓度为1×10¹⁰L^-1的细胞悬液，用吸管将6孔板中三维支架材料内的培养液吸干，采用反复滴加法在每片支架上滴加细胞悬液，直至支架不再吸液为止。置入体积分数5%CO₂、37 ℃孵箱内4 h后，沿6孔板壁缓慢滴加完全培养液3 mL，放入孵箱内培养，以后每2 d换液1次。

MTT细胞活性检测：分别于2，4，6，8，12 d各取出3片，弃去原培养液，分别加入2%MTT液1 mL，置于孵箱内4 h，取出后，每孔内滴加DMSO液1 mL，用吸管反复吹打支架约1 min，取96孔板，每孔内用吸液枪滴加150 μL，于490 nm波长下测其吸光度值(A值)；另取培养8 d的复合物作电镜及苏木精-伊红切片染色。

主要观察指标：观察纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合支架的理化性质、压缩力学性能，以及细胞生物相容性。

统计学分析：采用 SPSS 16.0统计软件包进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

为了促进骨生成种子细胞对支架材料的识别、黏附、增殖及形成新的骨细胞外基质，作为骨组织工程中关键因素的支架材料，不仅材料的特性，而且其结构特征都应与骨细胞生长的天然细胞外基质环境尽可能的相似^[15]。

有研究表明，作为组织工程生物支架材料应具有以下性能^[4^，^16]：①良好的生物相容性、稳定性，除满足生物材料的一般要求外，材料本身应对细胞无毒副作用。②良好的生物机械性能，对于承担负荷的组织工程的支架材料，必须具备足够的力学性能。③良好的生物降解性，对于良好的组织工程支架材料而言，要求生物材料的降解速率可以根据需要进行适当的调整。④良好的材料-细胞界面，应有利于细胞黏附、生长。⑤应能够做成三维立体多孔结构，这种结构可以提供更大的表面积和空间，以利于细胞黏附生长，并且可以构建需要的组织形态。

本实验制备的支架材料，压缩可变形，有一定压缩弹性，去除外力后可自动恢复至原状，可根据需要制备成不同三维形状及不同体积大小，能够满足骨组织工程试验对支架材料的最基本要求。

空白支架扫描电镜发现3种比例支架均具有不规则的多孔结构，但随着胶原蛋白含量的增加，支架材料孔径逐渐变小；反之，随着胶原含量下降，支架材料孔径逐渐增大，而支架孔径过大过小都不能满足种子细胞黏附、长入及增殖^[17-18]。在纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白质量比为1∶2∶5时，交通孔丰富、相通性好，孔径98-260 μm，总的平均孔径为167.82 μm，孔隙率为(549.37±35.29)%。根据接种细胞种类及支架材料的性能不同，对支架孔径大小和孔隙率的要求并非严格一致，但目前观点认为支架孔隙率越高^[19]，支架孔径与所植入细胞体积及细胞生长形态相匹配^[20]，可能越是性能良好的组织工程支架。

有文献报道，密质骨的压缩模量和压缩强度分别为7-30 GPa、100-230 MPa，而松质骨的压缩模量和压缩强度分别是0.05-0.5 GPa、2-12 MPa^[21]。本实验所制备的支架材料具有一定的压缩模量和压缩强度，在作为骨缺损修复时该材料具有一定的支撑能力。从图3可见，随机取出3个样本，其压缩应力应变曲线几乎完全一致，说明其可重复性高，所得结果可靠。

从以上各项指标的数据综合分析，由于纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白按质量比为1∶2∶5时，其孔隙率、孔径及压缩弹性等相应参数性能符合组织工程骨组织的构建要求，说明本实验制备的支架材料从物理性能上可以用于骨组织工程实验。但是用作组织工程支架，对细胞无毒无害，具有良好的生物相容性至关重要。

细胞毒性实验是评价生物材料生物相容性的指标之一。本实验采用MTT比色法^[22]，即细胞生长抑制法进行细胞活性评价。该方法的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数呈正比。该方法灵敏度高，经济实用，为目前实验常用检测细胞活性的手段。

由图6可见，细胞生长曲线呈现S型，符合目前细胞-支架培养的一般规律，即经过前期细胞黏附适应后，细胞进入对数生长期，曲线斜率突然增大；当细胞增殖到一定程度后，由于支架体积及营养、代谢等因素，细胞增殖开始减缓。根据GB/T 16886.5-2003中规定的细胞毒性分级标准^[23-35]，该实验材料的细胞相对增殖度均大于85%，结果诊断合格，表明该材料几乎不具有细胞毒性。

细胞-支架复合物培养2，6，8 d后进行石蜡切片苏木精-伊红染色，如图4可见第2天时支架内细胞数量很少，待第8天时可见细胞数量倍增，支架内部可见大量细胞。而细胞-支架培养8 d的扫描电镜可见，支架内部孔洞内大量细胞生长，细胞完全伸展、形态各异并有细胞基质分泌。此两项结果能够说明以下问题：该支架细胞相容性良好，对细胞无毒害作用；该支架孔径大小及孔隙率等适宜细胞长入、增殖。

综合以上，可以明确该纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合支架材料能够满足作为骨组织工程生物支架材料的基本要求，具有适宜的孔径，良好的孔隙率；能够制备成不同需要的三维立体形状；具有良好的材料-细胞界面，有利于细胞黏附、生长；对细胞、组织无毒副作用，具有良好的生物相容性。

纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/丝素蛋白复合支架材料具有良好的三维塑形特性、良好的细胞生物相容性，有望用于大面积骨组织缺损的修复。然而，若将其作为细胞载体材料进一步用于临床还需要深入的研究，如在不同解剖部位进行较长时间的实验来确定其具体的生物修复功能。

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